Uso de espectrometría de masa para identificación taxonómicas de flebotominos

La identificación taxonómica de vectores transmisores de enfermedades es clave para el control y manejo de epidemias. En los últimos años, enfermedades transmitidas por vectores han tomado gran importancia ya que debido al cambio climático y globalización están extendiéndose a zonas que no existían anteriormente. Ejemplos como esto están mosquitos Aedes (transmisores de dengue), garrapatas y flebotominos. Estos últimos son los transmisores del protozoario causante de Leishmaniasis. Esta es una enfermedad causada por protozoarios del genero Leishmania. Los síntomas, que van a depender de la especie de protozoario, van desde lesiones localizadas en la piel hasta metástasis de mucosas, y daños fatales a órganos (Neuber, 2008). Esta enfermedad es prevalente en zonas rurales de Ecuador (Calvopina, Armijos, & Hashiguchi, 2004).

Como se menciono anteriormente, la identificación precisa de vectores es necesaria para el control y manejo de las mismas. En el caso de flebotominos, esta identificación posee muchas dificultades, entre ellas están el considerable tiempo que toma la preparación de slides para análisis de cabeza y genitalia, además se requiere de una alta experticia para analizar estas estructuras. A esto se le puede añadir, la imposibilidad de identificación en caso que se encuentre especies cripticas, la falta de claves taxonómicas claras y especímenes incompletos o dañados en el transporte. En los últimos años el uso de barcoding ha sido usado con éxito para superar con algunas de estas dificultades, pero la variabilidad genética del locus usado para identificación es problemático. Para esto, una alternativa que ha tomado impulso en los últimos años es el uso la espectrometría de masa para identificación taxonómica.

Pheblotomus spp. («Phlebotomus sp 01». Publicado bajo la licencia Dominio público vía Wikimedia Commons - https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Phlebotomus_sp_01.jpg#/media/File:Phlebotomus_sp_01.jpg.)
Pheblotomus spp. («Phlebotomus sp 01». Publicado bajo la licencia Dominio público vía Wikimedia Commons – https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Phlebotomus_sp_01.jpg#/media/File:Phlebotomus_sp_01.jpg.)

Esta técnica llamada “matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry” (MALDI-TOF MS) permite la construcción de perfiles proteicos de especímenes. Esta técnica se usa rutinariamente para diagnostico clínico de hongos y bacterias. Una ventaja de esto es que los perfiles creados pueden ser compartidos entre laboratorios aumentando su reproducibilidad. MALDI-TOF MS ya ha sido probado en varios vectores como son garrapatas, mosquitos y culicoides en sus estadios de adulto, larvas y en huevos con muy buenos resultados. (Mathis et al., 2015) publico un articulo en Parasites & Vectors en el cual realizó la identificación de 20 especies de flebotominos provenientes de diferentes países (entre ellas de Ecuador) usando MALDI-TOF MS.

Los especímenes usados de Ecuador pertenecieron a Nyssomyia trapido, Psathyromyia (Foratiniella) aragaoi y Psychodopygus panamensi. Todas colectadas en el 2013 en el campo y preservadas en etanol al 96%. Para probar esta técnica lo primero que se realizó es la identificación taxonómica con claves usando cabeza y genitalia. Una vez identificados los especímenes, se tomo alas, tórax y patas para usarlos con MALDI-TOF MS. Se tomo 5 especímenes por especie para la construcción de la librería. Los remanentes del abdomen se usaron para barcoding usando Cyt b.

Para validar la técnica se utilizó 161 especímenes de 19 especies, 84 colectadas en el campo, 50 de colonias y 27 especímenes de colonias guardadas de años anteriores. Al final se identifico exitosamente 140 insectos. La sensibilidad y especificidad de esta técnica fueron de 87% y 97% respectivamente. Uno de los factores que afectan a los datos es el medio en que se guardan los insectos. Especímenes guardados en etanol al 70% presentaron problemas en la identificación mientras que insectos guardados en nitrógeno liquido no tuvieron problemas aun cuando fueron guardados mas de 25 años.

Aun cuando esta técnica soluciona algunos de los problemas en la identificación taxonómica todavía se requiere de un taxónomo experto para validar los datos y cuando se procesa especies cercanas o cripticas y gente que tenga mucha experiencia en espectrometría de masa. Se recomienda además crear una base de datos centralizada en vez de bases de datos de diferentes centros, esto para asegurar la homogeneidad en la calidad de los mismos.

Referencias

Calvopina, Manuel, Armijos, Rodrigo X, & Hashiguchi, Yoshihisa. (2004). Epidemiology of leishmaniasis in Ecuador: current status of knowledge-a review. Mem Inst Oswaldo Cruz, 99(7), 663-672.

Mathis, A., Depaquit, J., Dvorak, V., Tuten, H., Banuls, A. L., Halada, P., . . . Schaffner, F. (2015). Identification of phlebotomine sand flies using one MALDI-TOF MS reference database and two mass spectrometer systems. Parasit Vectors, 8, 266. doi: 10.1186/s13071-015-0878-2

Neuber, H. (2008). Leishmaniasis. J Dtsch Dermatol Ges, 6(9), 754-765. doi: 10.1111/j.1610-0387.2008.06809.x

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